E.O.Punina

Karyologische Studie der kaukasischen Vetreter der Gattung PAEONIA (PAEONIACEAE) unter Verwendung der Giemsa-Differential-Chromosomenfärbung

Botanitcheskij Journal 1989 74(3) 332-339

Übersetzung aus dem Russischen von Dr.Carsten Burkhardt, Cottbus

Bilder und Tabellen in Vorbereitung

Es wurde eine differentielle Färbung und Analyse der Verteilung der S-Segmente von metaphasischen Chromosomen bei 5 diploiden (P.caucasica, P.mlokosewitschi, P.ruprechtiana, P.tenuifolia, und P.lagodechiana) und 4 tetraploiden (P.wittmanniana, P.steveniana, P.macrophylla, P.tomentosa) Arten aus dem Kaukasus durchgeführt. Eine Reihe von Unterschieden zwischen den Arten wurde entdeckt. Aufgezeigt wird die autopolyploide Herkunft von P.wittmanniana und die allopolyploide Herkunft der anderen tetraploiden Arten. Es werden Vermutungen über das Ausmaß der phylogenetischen Verwandtschaft dieser Arten beschrieben. Karyologische Untersuchungen der kaukasischen Vertreter der Gattung Paeonia (Punina, 1987) haben gezeigt, daß alle untersuchten Arten mit einer Chromosomenzahl von 2n=10 sehr ähnliche Karyotypen aufweisen, welche sich nur in der absoluten Länge der Chromosomen unterscheiden, während der Centromer-Index und die relative Länge bei ihnen gleich sind. Bei den tetraploiden Arten (2n=20) zeigten die Karyotypen eine größere Mannigfaltigkeit.

Es wurde die Vermutung geäußert, daß die Tetraploiden P.wittmanniana autopolyploider, P.steveniana, P.macrophylla und P.tomentosa allotetraploider Herkunft sind. Zur genaueren Beurteilung dieser Frage wurde eine detailliertere Analyse aller Arten nach der S-Methode mit einer differentiellen Chromosomenfärbung empfohlen.

Bisher wurden differentielle Färbungen meiotischer Chromosomen bei Arten der Gattung Paeonia bei P.tenuifolia durchgeführt mit der S-Methode (Friebe, 1976), bei P.tenuifolia und P.officinalis L. - bei mitotischen Chromosomen mit Hilfe von Chromocin und Silber-zitrat (Schwarzacher-Robinson, 1986), des weiteren bei 6 Arten, die in Japan wachsen, mit Hilfe der S-Methode (Nakamura, Nomoto, 1982). Mit Ausnahme von P.tenuifolia, wurde eine differentielle Färbung der Chromosomen von kaukasischen Vertretern dieser Gattung bisher nicht durchgeführt.

Material und Methoden

Die differentielle Färbung wurde bei den gleichen Vertretern angewandt, bei denen die morphologische Chromosomenanalyse in der früheren Arbeit durchgeführt wurde (Punina, 1987), siehe Tabelle.

Die Pflanzen wurden in Containern in Erde kultiviert, die in der experimentellen Abteilung des Botanischen Institutes 'AN UdSSR V.L.Komarova'. Spitzen junger Wurzeln wurden nacheinander mit 0.05% Colchicin-Lösung für 2 Stunden und 0.02 M Oxychinolin für 1 Stunde behandelt. Danach wurde mit kalter Essigsäure im Kühlschrank für mindestens 16 Stunden fixiert, wie von L.I.Abramova (1977) empfohlen. Der meristematische Teil der Wurzeln wurde mit 45%-iger Essigsäure für 30-40 min bei Zimmertemperatur mazeriert, danach wurden Dauerpräparate angefertigt. Die Präparate wurden bis zu 48h bei Zimmertemperatur an der Luft getrocknet (Nakamura, Nomoto, 1982). Die Trockenpräparate wurden mit konzentrierter Ba(OH)2-Lösung bei 60°C für 10min behandelt, danach gespült mit 1n HCl, destilliertem Wasser und inkubiert in 2xSSC zuerst für 10min bei Zimmertemperatur, dann für 60min bei 60°C, erneut mit destilliertem Wasser gespült, getrocknet und mit 1%-iger Giemsa-Lsg. in verdünntem Phosphat-Puffer bei pH 6.8 gefärbt. Die Färbung dauerte 30min bis 24h, d.h. bis Chromosomen und interphasischen Kerne eine bläulich-lila Tönung annahmen, die Chromo-Zentren und Blöcke auf den Chromosomen aber keine himbeer- oder dunkel-violette Farbe hatten. Nach der Färbung wurden die Präparate mit destilliertem Wasser gespült, getrocknet, durch Butyl-Alkohol und Xylol geleitet und anschließend balsamiert. Die besten metaphasischen Apparate wurden mit einer 2000-fachen Vergrößerung mit Hilfe des Zeichengerätes RA-6 gezeichnet. Lage und Ausmaß der heterochromatischen Chromosomensegmente der untersuchten Arten wurde anhand der Analyse von mehreren metaphasischen Plastinen erstellt.

Ergebnisse der Untersuchungen

Diploide Arten

Die Verteilung der heterochromatischen Segmente auf den Chromosomen der diploiden Arten zeigt Bild 1.

Bei P.mlokosewitschi waren die centromer-nahen Segmente des I.Chromosomenpaares groß, beim II.-V.Paar mittelgroß. Satelliten wurden bei allen Chromosomenpaaren nachgewiesen mit Ausnahme von Paar III. Interkalare Segmente traten nicht auf. Beim Vergleich der Pflanzen von verschiedenen Herkunftsorten (Kedi bzw. Lagodechi) wurden keine Unterschiede festgestellt, deshalb wurde nur eine Zeichnung dargestellt.

Bei P.ruprechtiana waren alle centromer-nahen Segmente mittelgroß, Satelliten wurden bei allen Chromosomenpaaren nachgewiesen mit Ausnahme von Paar III. Beim II.Chromosomenpaar wurden in 2 Fällen von 5 interkalare Segmente in der Mitte des kurzen Armes gefunden.

Bei P.caucasica aus Saguramo waren die heterochromatischen centromer-nahen Segmente auf dem I.-III. und V.Chromosomenpaar groß, auf dem IV.Chromosomenpaar mittelgroß, Satelliten befanden sich auf dem II.,IV. und V.Paar, beim I. war der Satellit nur bei einem der homologen Chromosomen vorhanden. In der Mitte des kurzen Armes des II.Chromosomenpaares befindet sich ein interkalares Segment.

Bei P.caucasica aus Daba waren die heterochromatischen centromer-nahen Segmente auf dem I.-IV. Chromosomenpaar mittelgroß, auf dem V.Chromosomenpaar groß. Satelliten befanden sich auf allen Chromosomenpaaren, außer Paar III. Interkalare Segmente wurden nicht gefunden.

Bei P.tenuifolia waren die heterochromatischen centromer-nahen Segmente auf dem I.-IV. Chromosomenpaar mittelgroß, auf dem V.Chromosomenpaar klein. Satelliten befanden sich auf dem III.,IV. und V. Chromosomenpaar. Es ist erwähnenswert, daß die Satelliten auf dem III.Chromosomenpaar bei einer Färbung mit Fjolgren (Punina, 1987) nicht beobachtet werden konnten, sondern nur mit Hilfe der differentiellen Färbung.

Bei P.lagodechiana, die ein introgressiver natürlicher Hybrid zwischen P.caucasica und P.mlokosewitschi ist, zeigten sich centromer-nahe heterochromatische Segmente mittlerer Größe auf dem I.-IV.Chromosomenpaar, beim V.Paar zeigte sich eine Heteromorphie - bei einem Chromosom des Paares war das Segment mittelgroß, beim anderen Chromosom groß. Die I., II. und IV.Paare zeigten einen Heteromorphismus auch bei den Satelliten, beim I. und II.Paar befanden sich Satelliten nur auf einem Chromosomen des Paares, beim IV.Paar besitzt ein Chromosom einen besonders großen Satelliten, wie schon zuvor gezeigt werden konnte (Punina, 1987).

Tetraploide Arten

Bei den tetraploiden Arten stellte sich die Verteilung der heterochromatischen Segmente differenzierter dar (Bild 2):Bei P.wittmanniana (Bild 2,a) besitzen alle Chromosomenpaare centromer-nahe heterochromatische Segmente mittlerer Größe. Die I.-II. und VII.-X.Paare haben Satelliten. Außerdem, einmalig wurde ein heterochromatischer Satellit auf einem der Homologen des IV.Paares gefunden. Auf dem kurzen Arm von einem Chromosom des III.Paares befindet sich ein interkalares Segment.

Bei P.steveniana (Bild 2,b) besitzen die Chromosomenpaare I-IV,VI,VII und IX centromer-nahe heterochromatische Segmente mittlerer Größe, das X.Paar kleine, beim V. und VIII.Paar sind sie heteromorph, nur ein homologes Chromosom des V. Paares besitzt ein centromer-nahes Segment mittlerer Größe, und nur ein Homolog des VIII.Paares ein kleines. Heterochromatische Satelliten wurden auf dem kurzen Arm des II. und VII.-X. Chromosomenpaares beobachtet, und episodisch auf einem Chromosom des III. Paares. Interkalare Segmente wurden episodisch auf unterschiedlichen Abschnitten des II.-IV.Paares gefunden.

Bei P.macrophylla aus Adsharien (Bild 2,w) besitzen die II. und IX.Paare große centromer-nahe heterochromatische Segmente, I., II., IV., VI.Paare mittelgroße, V., VII und X.Paar kleine. Das VIII.Paar besitzt kein centromer-nahes Heterochromatin. Satelliten befinden sich auf den kurzen Armen des VII.-X. Chromosomenpaares, auf dem kurzen Arm eines Chromosoms des I. und III.Paares und auf dem langen Arm eines Chromosoms des II.Paares. Auf den kurzen Armen der IV. und V. Chromosomen traten die Satelliten episodisch auf. Interkalare Segmente traten einmalig auf dem langen Arm von einem Chromosom des VII.Paares auf.

Bei P.macrophylla aus Svanetien (Bild 2,g) besitzen die III., VI. und IX.Paare und ein Chromosom des IV.Paares große centromer-nahe heterochromatische Segmente. Segmente mittlerer Größe wurden beim I.und II.Paar festgestellt, kleine Segmente beim VII. und X.Paar und auf einem Chromosom des V.Paares. Beim VIII.Paar fehlen die centromer-nahen heterochromatischen Segmente, ebenso bei einem Chromosom des V.Paares. Satelliten befinden sich auf den kurzen Armen des VII.-X. Chromosomenpaares und auf einem Chromosom des VII.Paares, ebenso auf dem langen Arm der Chromosomen des II.Paares. Episodisch fanden sich Satelliten auf den kurzen Armen der III.-VI.Chromosomenpaare. Interkalare Segmente befinden sich immer auf dem langen Arm des Chromosoms des VII.Paares, das auch den Satelliten trägt. Einmalig traten interkalare Segmente auf dem kurzen Arm eines Chromosoms des III. und VI.Paares auf.

Bei P.tomentosa (Bild 2,d) sind große centromer-nahe Segmente auf dem X., mittelgroße auf dem III., allerdings nur auf dem kurzen Chromosomen-Arm, und kleine auf dem I.,II.,IV.,VII und IX.Chromosomenpaar zu finden, außerdem auf einem der Homologen des V. und VIII.Paares. Centromer-nahes Heterochromatin fehlte beim VI.Chromosomenpaar und einem der Chromosomen des V.und VIII.Paares. Satelliten konnten festgestellt werden auf den kurzen Armen des I.,III.,VII., IX. und X.Chromosomenpaares und episodisch auf dem kurzen Arm von einem Chromosom des II. und VIII.Paares. Interkalare Segmente mittlerer Größe befinden sich auf dem langen Arm der Chromosomen des VII.Paares.

Diskussion

Die vorliegende Untersuchung zeigt wesentliche Ähnlichkeiten im Charakter der Anordnung der heterochromatischen Chromosomensegmente bei den diploiden Arten der Gattung - P.mlokosewitschi, P.caucasica und P.ruprechtiana. Lediglich P.mlokosewitschi stellt sich zweifellos als souveräne Art dar, die sich ebenso wie in der Gesamtheit der äußeren morphologischen Merkmale von den anderen diploiden Arten gut unterscheiden läßt. Es konnte gezeigt werden, daß die Karyotypen dieser Art eine große Ähnlichkeit mit den Karyotypen von P.caucasica und P.ruprechtiana besitzen (Punina 1987). Außerdem konnte die Leichtigkeit seiner Kreuzung sowohl auf natürlichem Wege, als auch künstlich mit P.caucasica nachgewiesen werden (Kakheladse, 1965; Kemularia-Nathadse, 1980), ebenso eine Ähnlichkeit im anatomischen Aufbau des Spermoderms dieser Art mit der von P.caucasica (Melikjan, Astrazatran, 1971). All das bezeugt die nahe Verwandtschaft von P.mlokosewitschi und P.caucasica, weshalb es uns unzweckmäßig erscheint, diese Arten in unterschiedliche Sektionen einzuordnen, wie von Kemularia-Nathadse (1961) geschehen, oder Subsektionen, wie bei M.S.Uspenskaja (1987). Wir halten uns aber davor zurück, eine abschließende Feststellung des Platzes von P.mlokosewitschi im System der Gattung zu dieser Zeit vorzunehmen, solange nicht weitere Erkenntnisse über diese Arten vorliegen.

Bei der Analyse der S-Segmente der Chromosomen von P.ruprechtiana zeigte sich, daß sich die von P.caucasica und P.ruprechtiana voneinander nicht mehr unterscheiden, als die von P.caucasica aus verschiedenen Herkunftsorten. Morphologisch ist P.ruprechtiana mit P.caucasica sehr ähnlich, was gestattet, ihre Eigenständigkeit anzuzweifeln. Zum anderen sind, wie bereits früher gezeigt wurde (Punina, 1987), die Chromosomen von P.caucasica verschiedener Herkünfte in der absoluten Länge gleich lang, während sie bei P.ruprechtiana größer sind, als bei P.caucasica. Deshalb halten wir uns abermals zurück vor einem abschließenden Urteil über die systematische Einordnung von P.ruprechtiana zu diesem Zeitpunkt, solange nicht weitere Angaben über die DNA bei den kaukasischen Arten der Gattung Paeonia zur Verfügung stehen. P.tenuifolia unterscheidet sich im Verteilungsmuster der S-Segmente gut von den anderen diploiden Arten. So wurden nie Satelliten auf dem I. und II.Chromosomenpaar gefunden, während sie auf dem III.Paar beobachtet wurden, wobei diese hier nur mit Hilfe der differentiellen Färbung aufgezeigt werden konnten. Das V.Paar besitzt nur sehr wenig centromer-nahes Heterochromatin, außerdem erscheint das Segment nicht als Zone, wie bei den anderen Arten, sondern als kleine paarige Punkte. Daraus folgt, daß die von uns gezeigte Anordnung der S-Segmente auf den Chromosomen von P.tenuifolia in weiten Zügen übereinstimmt mit der Anordnung der Kern-Organisations-Regionen, die von Schwarzacher-Robinson bei Färbung mit Silbernitrat bemerkt wurde.

Bei den tetraploiden Arten gestaltete sich die Kartierung der Anordnung der S-Segmente differenzierter als bei den diploiden.

Bei P.wittmanniana fanden wir überhaupt keine wesentlichen Unterschiede in der Verteilung der S-Segmente zwischen I./II, III./IV., V./VI., VII./VIII. und IX./X. Chromosomenpaar. Die Ähnlichkeit in der absoluten Länge und dem Centromer-Index wurde bereits früher nachgewiesen (Punina, 1987).Bei dieser Art kann man nicht nur von Chromosomenpaaren, sondern vielmehr von „Vierergruppen“ sprechen. Wir betrachten P.wittmanniana als auto-tetraploide Art und die differentiellen Chromosomenfärbungen bestätigen diese Auffassung.

Ein anderes Bild der Anordnung der heterochromatischen Segmente zeigt sich bei P.steveniana und P.macrophylla. Bei diesen Arten unterscheiden sich die Chromosomen gut in der Verteilung der

centromer-nahen Segmente. Unterschiede in der absoluten Länge und im Centromer-Index zwischen I./II, III./IV., V./VI., VII./VIII. und IX./X.Chromosomenpaar wurden bereits früher festgestellt (Punina, 1987), was die Vermutung zuließ, daß diese Arten Allo-Tetraploide sind, d.h. hybrider Herkunft. Die Verteilungsmuster bei der differentiellen Färbung bestätigen das ebenso. Wie auf Abb.2 (b-g) sichtbar, ist in jeder „Vierergruppe“ von Chromosomen, die sich im Centromer-Index ähnlich sind, ein Paar mit großen oder mittelgroßen centromer-nahen Segmenten und ein Paar mit kleinen oder insgesamt fehlenden Segmenten enthalten.

Es bleibt anzumerken, daß Zahl und Anordnung der Satelliten bei diesen Arten manchmal nicht mit dem übereinstimmte, was bei der morphologischen Chromosomenanalyse nach Färbung mit Fjolgren beobachtet wurde (Punina, 1987). Bei dieser Färbung war eine Unterscheidung von gut sichtbaren und umgebogenen Satelliten nicht möglich, und wenn bei einzelnen Chromosomenpaaren Satelliten bemerkt wurden, obwohl sie nur einmalig auftraten, wurden diese Paare als satelliten-tragend bezeichnet. In der vorliegenden Untersuchung wurden Chromosomen nur als satelliten-tragend bezeichnet, wenn sich deren Vorhandensein mindestens 3 mal bestätigen ließ. Bei der Färbung mit Giemsa zeigte sich, daß weitere Chromosomenpaare heteromorphe Satelliten besitzen, wie zum Beispiel das VII.Paar von P.macrophylla aus Svanetien. Ein Vergleich der Chromosomen von P.macrophylla aus unterschiedlichen Naturstandorten ergab, daß die Unterschiede zwischen diesen Populationen sehr gering waren, wenn man die bemerkenswerte geographische Distanz zwischen beiden in Betracht zieht.

Bei P.steveniana ergab die Kartierung der heterochromatischen Segmente ein ähnliches Bild, wie bei P.macrophylla, was Zweifel aufkommen läßt, diese Art als selbständig zu betrachten, wie es von Kemularia-Nathadse (1961) vorgeschlagen wurde. Uspenskaja (1987), die 17 Arten der Gattung Paeonia nach 24 morphologischen Merkmalen analysierte, stellte fest, daß sich P.macrophylla und P.steveniana nur in einem Merkmal unterschieden. Die Areale dieser Arten liegen nahe beieinander. Deshalb halten wir es für möglich, daß P.steveniana und P.macrophylla keine eigenständigen Arten, sondern nur Varianten ein und derselben Art darstellen.

Betrachtet man die Verteilung von Heterochromatin bei P.tomentosa, bemerkt man vor allem, daß es quantitativ wenig ist. Von 20 Chromosomen besitzen 4 überhaupt kein centromer-nahes Heterochromatin und 8 haben nur kleine centromer-nahe Blöcke. Auf dem langen Arm des VII.Paares befindet sich ein interkalares Segment, das bei den anderen Arten nie auftrat. Die IX. und X. Chromosomenpaare sehen im Vergleich mit ihren Homologen bei P.steveniana und P.macrophylla aus wie „getauschte Plätze“: das Paar mit den langen Armen besitzt einen kleinen, punktförmigen centromer-nahen Block, das mit den kürzeren einen großen, so wie bei P.steveniana und P.macrophylla, nur umgekehrt. In dieser Hinsicht unterscheidet sich P.tomentosa deutlich von den anderen tetraploiden Arten, abgesehen von P.wittmanniana, die, wie weiter oben ausgeführt, als Autotetraploid anzusehen ist. Aufgrund dieser prinzipiellen Unterschiede in der Abstammung sehen wir es als unberechtigt an, daß diese Arten in eine Serie eingeordnet werden, wie von Kemularia-Nathadse (1961) und Uspenskaja (1987) geschehen, sondern schlagen vor, P.steveniana und P.wittmanniana in verschiedene Serien einzugliedern.